原位雜交方法
日期：2025-07-05 01:27
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摘要：
原位雜交是在分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，是在研究生物體發(fā)育過(guò)程中的一種極為重要的分子遺傳學(xué)的研究方法。其英文名為insitu hybridization,其中in situ為拉丁文，原義是"in its natural position".字面的意思理解就是說(shuō)在其原來(lái)的天然的位置處雜交。
原位雜交主要是基于以下這個(gè)主要原理：?jiǎn)捂湹腄NA或者RNA只要他們的序列是互補(bǔ)的，即符合AT，CG的堿基配對(duì)原則，那么這樣的兩條核酸鏈之間（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一個(gè)穩(wěn)定的雜交復(fù)合體。這一原理對(duì)于檢測(cè)一個(gè)特異的mRNA在某一種生物體，或者某些組織切片、單個(gè)細(xì)胞里具體表達(dá)位置非常有用。該技術(shù)*早應(yīng)用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高，并可**定位，因此該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，例如與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以觀察該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水平。
原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對(duì)于那些細(xì)胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時(shí)由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。核酸原位雜交可根據(jù)其檢測(cè)物而分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)其所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經(jīng)過(guò)組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交，雜交，沖等一系列洗步驟及放射自顯影或**酶法顯色以顯示雜交結(jié)果。我們?cè)谶@兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對(duì)細(xì)胞和組織切片進(jìn)行探針雜交及檢測(cè)的原位雜交，而是對(duì)完整的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行探針雜交及檢測(cè)，從整體上把握探針的結(jié)合部位，然后對(duì)胚胎進(jìn)行切片，以確定探針結(jié)合的具體位置。整胚原位雜交在斑馬魚(yú)分子生物學(xué)研究中是一種非常重要的實(shí)驗(yàn)方法，原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來(lái)檢測(cè)；也可以是非同位素的探針，通過(guò)熒光或酶法予以檢測(cè)。我們這兒所介紹的一種原位雜交的方法是通過(guò)后者，以地高辛標(biāo)記探針，然后用酶聯(lián)抗體的方法進(jìn)行檢測(cè)。
原位雜交（In situ hybridazation）
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養(yǎng)，可阻斷色素的形成）
一. 原位雜交第**
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
2） 置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次
4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定環(huán)節(jié)
1）用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(zhǎng)。發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫
2. 預(yù)雜交
1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB－溶液，Thermobrite原位雜交儀60℃5分鐘，避免振蕩
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）Thermobrite 原位雜交儀60℃預(yù)雜交4小時(shí)以上。
3. 雜交
1）吸去預(yù)雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）.
2）Thermobrite原位雜交儀60℃ 溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預(yù)雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結(jié)合越好，溫度越高，背景越小。
二. 原位雜交**天
首先
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復(fù)使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。
3）置換2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次
**
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時(shí)間為一小時(shí)
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過(guò)夜。
三. 原位雜交第三天
1）用1ml含10％熱滅**清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，*后用1mlMABT溶液置換，25分鐘
2） 用1ml 1mM**米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘
3）將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple APSubstrate(底物，用之前加5mM**米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色
4）每隔一小時(shí)觀察胚胎是否開(kāi)始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照
6）4C冰箱保存
儀器配置：
原位雜交中溶液的配制：
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 調(diào)PH值至7.4 后 抽濾，**
4% 多聚甲醛多聚甲醛：40g PBS 1L 加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清，-20℃保存。
PBST：PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽濾，**
SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB:甲酰胺：20XSSC儲(chǔ)液：
DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存
HYB+：HYB- 20ml;yeast RNA 10mg
原位雜交主要是基于以下這個(gè)主要原理：?jiǎn)捂湹腄NA或者RNA只要他們的序列是互補(bǔ)的，即符合AT，CG的堿基配對(duì)原則，那么這樣的兩條核酸鏈之間（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一個(gè)穩(wěn)定的雜交復(fù)合體。這一原理對(duì)于檢測(cè)一個(gè)特異的mRNA在某一種生物體，或者某些組織切片、單個(gè)細(xì)胞里具體表達(dá)位置非常有用。該技術(shù)*早應(yīng)用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高，并可**定位，因此該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，例如與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以觀察該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水平。
原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對(duì)于那些細(xì)胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時(shí)由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。核酸原位雜交可根據(jù)其檢測(cè)物而分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)其所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經(jīng)過(guò)組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交，雜交，沖等一系列洗步驟及放射自顯影或**酶法顯色以顯示雜交結(jié)果。我們?cè)谶@兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對(duì)細(xì)胞和組織切片進(jìn)行探針雜交及檢測(cè)的原位雜交，而是對(duì)完整的斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行探針雜交及檢測(cè)，從整體上把握探針的結(jié)合部位，然后對(duì)胚胎進(jìn)行切片，以確定探針結(jié)合的具體位置。整胚原位雜交在斑馬魚(yú)分子生物學(xué)研究中是一種非常重要的實(shí)驗(yàn)方法，原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來(lái)檢測(cè)；也可以是非同位素的探針，通過(guò)熒光或酶法予以檢測(cè)。我們這兒所介紹的一種原位雜交的方法是通過(guò)后者，以地高辛標(biāo)記探針，然后用酶聯(lián)抗體的方法進(jìn)行檢測(cè)。
原位雜交（In situ hybridazation）
收集斑馬魚(yú)的胚胎，在Holfretor水中培養(yǎng)，到達(dá)所需要的發(fā)育時(shí)期時(shí)，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時(shí)后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養(yǎng)，可阻斷色素的形成）
一. 原位雜交第**
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
2） 置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次
4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定環(huán)節(jié)
1）用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(zhǎng)。發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫
2. 預(yù)雜交
1）每個(gè)管中置換成大約300ulHYB－溶液，Thermobrite原位雜交儀60℃5分鐘，避免振蕩
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）Thermobrite 原位雜交儀60℃預(yù)雜交4小時(shí)以上。
3. 雜交
1）吸去預(yù)雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）.
2）Thermobrite原位雜交儀60℃ 溫浴過(guò)夜。
注：雜交與預(yù)雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結(jié)合越好，溫度越高，背景越小。
二. 原位雜交**天
首先
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復(fù)使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。
3）置換2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次
**
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時(shí)間為一小時(shí)
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過(guò)夜。
三. 原位雜交第三天
1）用1ml含10％熱滅**清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時(shí)以上，*后用1mlMABT溶液置換，25分鐘
2） 用1ml 1mM**米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘
3）將胚胎轉(zhuǎn)入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple APSubstrate(底物，用之前加5mM**米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動(dòng)，室溫下顯色
4）每隔一小時(shí)觀察胚胎是否開(kāi)始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照
6）4C冰箱保存
儀器配置：
原位雜交中溶液的配制：
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 調(diào)PH值至7.4 后 抽濾，**
4% 多聚甲醛多聚甲醛：40g PBS 1L 加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清，-20℃保存。
PBST：PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽濾，**
SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB:甲酰胺：20XSSC儲(chǔ)液：
DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存
HYB+：HYB- 20ml;yeast RNA 10mg